coip原理及实验步骤

1、一、试剂准备1.预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机。2.用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS。3.加入预冷的RIPA Buffer(1 ml/107个细胞、10 cm培养皿或150 cm2培养瓶，0.5 ml/5×106个细胞、6 cm培养皿、75 cm2培养瓶）。4.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15 min（EP管插冰上，置水平摇床上）。5.4℃，14000 g离心15 min，立即将上清转移到一个新的离心管中。6.准备Protein A agarose，用PBS 清洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。7. 每1 ml总蛋白中加入100 μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10 min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景。8. 4℃，14000 g离心1 5min，将上清转到一个新的离心管中，除去Protein A的珠子。

3、二、免疫共沉淀反应1．转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30 min,细胞裂解液于4°C，最大转速离心30 min后取上清；2． 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；3． 取10 μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3 000 rpm离心3 min；4.． 将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4 h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；5． 免疫沉淀反应之后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心的吸去，琼脂糖珠用1 ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15 μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；6． SDS-PAGE，Western blotting或质谱仪分析。

5、6．吸取出混合物的液体部分。加入800 μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min；7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜；8．通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带；9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1 ml 50%乙腈洗两次，每次3 min；10． 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱；11． 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。